標(biāo)準(zhǔn)曲線法也稱為外標(biāo)法或直接比較法，是一種簡便、快速的定量方法，在ELISA實驗中比較常用的一種分析方法。
一、做標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品檢測時有幾個問題需要注意ELISA試劑盒
1、樣品的濃度等指標(biāo)是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出來的，所以首先要把做標(biāo)準(zhǔn)曲線看作是比做正式實驗還要重要的一件事，否則后面的實驗結(jié)果無從談起。
2、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍要有一個比較大的跨度，并且要能涵蓋你所要檢測實驗樣品的濃度，即樣品的濃度要在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍之內(nèi)，人ELISA試劑盒包括上限和下限。而對于呈S型的標(biāo)準(zhǔn)曲線，盡量要使實驗樣品的濃度在中間坡度陡段，即曲線幾乎成直線的范圍內(nèi)。
3、采用倍比稀釋法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線中的標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度，這樣就能夠保證標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度不會出現(xiàn)較大的偏離。
4、檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品時，應(yīng)按濃度遞增順序進(jìn)行，以減少高濃度對低濃度的影響，提高準(zhǔn)確性。
5、標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品數(shù)一般為7個點(diǎn)，但至少要保證有5個點(diǎn)。
6、做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)因?qū)嶒炓蟛煌兴儎樱话銇碚f，相關(guān)系數(shù)R至少要大于0.98，對于有些實驗，至少要0.99甚至是0.999.
二、選擇什么方程去擬合ELISA試劑盒
在S曲線的低濃度部門可以用乘冪方程很好的擬合，中低濃度部門可以用直線方程，中間部門可用對數(shù)方程，而中后段可用四參數(shù)。免疫檢測時尺度點(diǎn)(可以是倍比稀釋的，也可以不是)濃度假如和相應(yīng)的吸光度(OD)值假如能夠呈現(xiàn)直線關(guān)系當(dāng)然是理想的了，這時可以通過EXELL等利便的獲得擬合曲線，進(jìn)而推算出樣品的濃度值。
關(guān)于尺度曲線的擬合方式，直線、二次曲線、三次曲線、指數(shù)、對數(shù)等雖都可用于ELISA及其它生物學(xué)反應(yīng)中的曲線擬合，但都只合用于曲線的一部門，有的合用于前半段，有的合用于后半段，有的合用于中間一段，而Logistic曲線則對曲線的全部都有較好的合用性。在一個長的區(qū)間內(nèi)，Logistic應(yīng)該都能擬合得較為理想。假如用來定量，S形曲線的中間段(較陡處)是比較好的，而兩真?zhèn)€平坦部門計算誤差會大，有時甚至?xí)艽蟆Ｓ糜诿庖邫z測的所謂“尺度曲線”實在稱為擬合曲線比較合適。目前上流行的免疫檢測擬合方式是“四參數(shù)邏輯擬合”，用這種擬合方式往往能夠比較準(zhǔn)確的反映濃度和吸光度的曲線關(guān)系，從而進(jìn)一步比較準(zhǔn)確的獲得樣品中待測物質(zhì)的濃度值。但我們做免疫檢測很少有時候能夠有這么理想的情況，標(biāo)品濃度和相應(yīng)OD值往往是"ELISA試劑盒S"型的曲線關(guān)系，這時就不能用直線擬合的方式了，而對擬合方法進(jìn)行選擇就是必要的了。樞紐在于你的尺度曲線做到了S形的哪一部門，你想檢測的樣品濃度在曲線的哪一部門。人ELISA試劑盒當(dāng)然，假如用于定量，仍是在中間一段較好。但建模型是一回事，而用它來定量是另一回事。這些方法固然沒有一種方法可以通用，但也都可以用。但并不是說它就是萬能的。事實上不僅是ELISA試劑盒，其它良多生物學(xué)反應(yīng)都是S形曲線，也都可以用Logistic曲線擬合。
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