細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)染方法
對(duì)于大部分的細(xì)胞系， DNA與DNAfect的比例在1:2至1:3時(shí)轉(zhuǎn)染效率較高。為了提高轉(zhuǎn)化效率、表達(dá)水平并且減少細(xì)胞毒性，實(shí)驗(yàn)應(yīng)在細(xì)胞密度較大時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以下操作以24孔板每孔細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染操作為例。
1. 貼壁細(xì)胞：轉(zhuǎn)化前一天，在24孔板的每孔中加入500 μl無抗生素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并于每孔中接種0.5-2×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至80-90%滿時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
懸浮細(xì)胞：在細(xì)胞轉(zhuǎn)染之前，在24孔板的每孔中加入500 μl無抗生素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并于每孔中接種3-5×105
個(gè)細(xì)胞。
2. 轉(zhuǎn)染當(dāng)天，首先準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，對(duì)于每孔細(xì)胞按照以下用量配制：
a. 取適量DNA，加入25 μl無血清培養(yǎng)基，并輕輕的混合均勻。
b. 取適量DNAfect，加入25 μl無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，并于室溫孵育5分鐘。
c. 孵育5分鐘之后，將稀釋的DNA和稀釋的DNAfect混合（使DNA以及DNAfectin的終總體積為50 μl），輕輕 混合均勻，并在室溫下孵育20分鐘（溶液可能會(huì)出現(xiàn)絮狀，但不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率） 注意：該混合物在室溫下可以穩(wěn)定保存6小時(shí)。
3. 將步驟1中24孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基更換成450 μl無血清培養(yǎng)基，然后將步驟2中50 μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到
24細(xì)胞孔板內(nèi)，輕輕前后推動(dòng)24孔板以混勻。
4. 將細(xì)胞置于含5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)4-6小時(shí)后，更換成500 μl生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
5. 18-48小時(shí)后進(jìn)行轉(zhuǎn)染基因表達(dá)的檢測(cè)。
6. 對(duì)于穩(wěn)定的細(xì)胞系：在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，細(xì)胞按照1:10的比例傳代，第二天可加入篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。
注：（1） 該說明為一個(gè)24孔的用量，若同時(shí)轉(zhuǎn)幾個(gè)孔，配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物的量需加倍；若轉(zhuǎn)染其他類型孔板，DNA和DNAfect用量見附表，該附表用量以293T細(xì)胞為轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)用量。
（2） 轉(zhuǎn)染4-6小時(shí)后也可以不更換生長(zhǎng)培養(yǎng)基，但由于DNAfect具有一定的細(xì)胞毒性，作用時(shí)間過長(zhǎng)可能使某些細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡現(xiàn) 象，建議更換生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
（3） 優(yōu)化條件：想要得到更高的轉(zhuǎn)染效率，應(yīng)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件：培養(yǎng)物、DNA濃度、細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞與DNA復(fù)合物的孵育時(shí)間等條件都 應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化。
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