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鄰苯二醛組胺熒光法的操作程序及注意事項解析

更新時間:2013-07-29   點擊次數(shù):2761次

鄰苯二醛組胺熒光法的操作程序及注意事項解析 
      1.操作程序
    (1)標(biāo)本制備:新鮮組織冰凍切片或鋪片,風(fēng)干后移至含P2O5的干燥器中繼續(xù)于燥4小時;固定的組織標(biāo)本石蠟切片,脫蠟后風(fēng)干;
    (2)鄰苯二醛處理:將40mg結(jié)晶鄰苯二醛加入已預(yù)熱至100℃的立式染色缸內(nèi),蓋好,約15分鐘后,取出染色缸,立即將干燥好的組織切片或鋪片移人染色缸內(nèi)2—3分鐘;也可在室溫下將1%鄰苯二醛的乙基苯液直接滴加在切片或鋪片上反應(yīng)4分鐘;
    (3)濕化:將標(biāo)本移至濕盒內(nèi)(但勿與水直接接觸)2~4分鐘;
    (4)80℃烘箱中作用5分鐘;
    (5)封片、熒光顯微鏡觀察分析同前;
    (6)結(jié)果:含組胺較高的細(xì)胞呈黃色熒光;組胺含量較少的細(xì)胞呈藍(lán)色熒光。

    2 .原理 
在一定溫度和濕度下,組織細(xì)胞內(nèi)的組胺與鄰苯二醛(OPT)發(fā)生聚合反應(yīng)。形成的聚合產(chǎn)物發(fā)出兩種熒光,一是組胺含量高時,呈黃色熒光,比較穩(wěn)定,zui大激發(fā)波長為405nm;二是組胺含量低時。呈藍(lán)色熒光。不穩(wěn)定,褪色較快。zui大激發(fā)波長為365nm。
    3.注意事項    
    (1)組胺含量低時,與鄰苯二醛縮合反應(yīng)的熒光團(tuán)不穩(wěn)定,熒光易淬滅,需盡快觀察記錄;
    (2)鄰苯二醛與胰高血糖素等一些多肽的氨基末端組氨酸反應(yīng)亦可形成較強熒光產(chǎn)物;
    (3)濕化處理較為關(guān)鍵,需嚴(yán)格控制;
    (4)對照實驗:省略鄰苯二醛液處理步驟,結(jié)果應(yīng)為陰性。

組胺(HA)是一種血管活性物質(zhì)和致痛物質(zhì),存在于外周肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞以及  胃黏膜一些內(nèi)分泌細(xì)胞的顆粒中,也存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一些神經(jīng)元突觸小泡內(nèi)。

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